応用生命化学実験１ー分子細胞生物学実験の部

　

１　ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるタンパク質の分析

目的

種々の形態と電荷を持つタンパク質を分子量に従って分画・分析する。

方法

２ーメルカプトエタノールで還元してＳ−Ｓ結合を切りタンパク質の２次構造を壊しかつ高温で変性したタンパク質にＳＤＳのミセルを吸着させることによりタンパク質分子に一定密度の負電荷を与えて電場中で泳動させる。この泳動を重合したアクリルアミドやアガロースのような網目状高分子中で行うと、大きい分子ほど抵抗を受けて遅くなり、この結果分子の大きさに従ってタンパク質が分離することになる。

材料と方法

＜STOCK-SOLUTIONS＞

アクリルアミド溶液

25ml 100ml
アクリルアミド(g) 11.1 44.4
メチレンビスアクリルアミド(g) 0.3 1.2

　　　

過硫酸アンモニウム（用時調製）

　　　　　　　1ml
過硫酸アンモニウム(g) 　　　　　　　　0.1

　

1.5M トリス塩酸緩衝液

　 　　　50ml　 　　100ml
トリス(g) 　　　9.08 　　 18.15

　　　　　　　　　　　　塩酸 (pH8.8)まで

　

0.5Mトリス塩酸緩衝液　

　 　　　50ml　 　　100ml
トリス(g) 　　　3.0 　　 6.0

　　　　　　　　　　　　塩酸 (pH6.8)まで

10%ＳＤＳ　　

　 　　　20ml 　　50ml
ＳＤＳ(g) 　　　 2 　　 5

　

泳動用緩衝液(10X)

100ml 200ml
トリス(g) 　 3 6
グリシン(g) 　　 14 24

　　　

ＳＤＳ試料液(2X)

　　　10ml 　　　100ml
　0.5Mトリス−塩酸　(ml) 　　　0.4 　　4.0
ＳＤＳ　(g)　　 　　0.376 　　3.76
グリセリン　(ml) 　　　4.0 　　40
2ｰメルカプトエタノール(ml) 　　0.4 　　4.0
ＢＰＢ(mg) 　　　1 　　10

　　　

　＜WORKING SOLUTIONS＞

分離ゲル（ゲル2枚分）　　 　　

ゲル濃度 　　7.5％ 　　10% 　　12.5 　　15%
アクリルアミド(ml) 　　　6.8 　　　9.1 　　11.3
蒸留水(ml) 　　22.4 　　20.1 　　17.9
1.5Mトリスｰ塩酸(ml)　 　　　　　　　　　10
10%ＳＤＳ(ml) 　　　　　　　　0.4
過硫酸アンモニウム(ml) 　　　　　　　　0.4
　　ＴＥＭＥＤ(ml) 　　　　　　　0.004
合計 　　　　　　　40.4ml

　

濃縮ゲル（ゲル2枚分）　

ゲル濃度 　　　　3% 　　　　5%
アクリルアミド(ml) 　　　0.66 　　　　1.1
蒸留水(ml) 　　　　6.6 　　　　6.2　
0.5Mトリスｰ塩酸(ml) 　　　　　　　　2.5
10%ＳＤＳ(ml) 　　　　　　　　0.1
過硫酸アンモニウム(ml) 0.1 0.1 　　　　　　　　0.1
ＴＥＭＥＤ(ml) 0.01 0.01 　　　　　　　　0.01
合計 　 　　　　 (10.01ml)

　

泳動用緩衝液　　　　　　

　　　　　　　 2.5L
(10X)泳動用緩衝液(ml) 　　　　　　　250
10%ＳＤＳ(ml) 　　　　　　　　25
蒸留水で２．５Lにする

染色液

　 100ml

　　ｸﾏｼｰﾌﾞﾘﾘｱﾝﾄﾌﾞﾙｰ(g) ・・・・ 0.25　ｇ　

　　メチルアルコール(ml)・・・　 50　ml　

　　酢酸(ml) 　・・・・・・・・　20　ml

　　水(ml) 　・・・・・・・・・　 30　ml

　

脱色液

　　250ml 　　1l
メチルアルコール(ml) 　　 63 　　250
酢酸(ml) 　　18 　　 70
水(ml) 　 　　169 　　680

　

　

　

２　核酸の抽出と分析

　

材料　エンドウ黄化芽生え

抽出バッファー

バッファー平衡化フェノール

フェノール・クロロホルム

フェノールの平衡化

　

核酸抽出用フェノール　　　　　５００ｇ

クロロホルム　　　　　　　　　　３Ｌ

エタノール　　　　　　　　　　５００ｍｌ

アガロース

　

グリオキザール変性

各班２本づつ。　１ｇ　５ｍｌ

アガロース電気泳動

　

３　植物細胞からの細胞骨格の分画

細胞骨格抽出用緩衝液（ＣＳＢ）の調製

　

Stock　Solutions

0.5N KOH 2.8g

蒸留水で100mlとする。

　　

100 mM HEPES-KOH (pH7.5)

HEPES 1.19g

0.5N KOH 6.40ml

蒸留水で50mlとする。

　

100 mM 酢酸マグネシウム

酢酸マグネシウム　　　　　　　　2.15g

蒸留水で100 mlとする。

　

10 % PTE（中性界面活性剤）

PTE

(Polyoxyethylene(10)tridecyl Ether) 1 ml

蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　　 9 ml

　

　

<Working Solution>

　

ＰＣＳＢ（CSB+PTE)

原液 用量 終濃度

100 mM HEPES-KOH(pH7.5) 5.0 ml 5 mM

100 mM 酢酸マグネシウム 10.0 ml 10 mM

0.5 M EGTA(GEDTA) 0.4 ml 2 mM

0.1 M PMSF-NaOH 1.0 ml 1 mM

10 % PTE 0.5 ml 0.5 %

蒸留水　　　　　　　　　　　　　　　83.1 ml　　　　

100.0 ml

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