ポリソームの分離と分析


遺伝子から転写されたmRNA上にリボソームがいくつも並びタンパク質合成を行います。このようなリボソームの集合体をポリソームといい、活発にタンパク質合成をしている組織に多く含まれ、しばしば細胞質の20%以上を占めることがあります。従って、mRNAの抽出の材料や細胞や組織の活性の目安などとして使われます。

1. 組織をポリソームを安定化させるバッファー中で破砕する。(10−25mM Mgと適当な濃度のTris または Hepes バッファー(pH7−8.5)をもちいる。例 200mM TrisHCl (pH8.5) 25mM MgCl2、50mM KOAc (Larkins&Davies 緩衝液); 5 mM HEPES−KOH (pH7.5)、10 mM MgCl2 2 mM EGTA、1mM PMSF(CSB: Abe & Davies)。膜系(RER)を破壊するためには0.5−2%の中世界面活性剤がこれらに加えられる。

2. 遠心により遊離したポリソームを含む上清あるいは膜結合や細胞骨格結合ポリソームを含むペレットを得る。

3. 上清画分は直接超遠心(300,000xg 1−3時間)によりポリソームを沈降させる。ペレット画分の場合はそのままあるいはペレットを溶解するバッファーを用いて結合型ポリソームを遊離させ上清画分と同様に超遠心により沈降させポリソームペレットを得る。

 

ポリソームの分析は、上清のときはそのまま、ペレットのときは適当にけんだくしあるいは膜や細胞骨格成分から遊離させてしょ糖密度勾配を用いて密度勾配遠心法により分析する。

活発に成長しているエンドウ胚軸の先端細胞におけるポリソームの大きさの分布を示したのが次の図です。

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