応用生命化学実験1ー分子細胞生物学実験の部

 

1 SDS−PAGEによるタンパク質の分析

目的

種々の形態と電荷を持つタンパク質を分子量に従って分画・分析する。

方法

2ーメルカプトエタノールで還元してS−S結合を切りタンパク質の2次構造を壊しかつ高温で変性したタンパク質にSDSのミセルを吸着させることによりタンパク質分子に一定密度の負電荷を与えて電場中で泳動させる。この泳動を重合したアクリルアミドやアガロースのような網目状高分子中で行うと、大きい分子ほど抵抗を受けて遅くなり、この結果分子の大きさに従ってタンパク質が分離することになる。

材料と方法

STOCK-SOLUTIONS

アクリルアミド溶液

25ml 100ml
アクリルアミド(g) 11.1 44.4
メチレンビスアクリルアミド(g) 0.3 1.2

   

過硫酸アンモニウム(用時調製

       1ml
過硫酸アンモニウム(g)         0.1

 

1.5M トリス塩酸緩衝液

     50ml    100ml
トリス(g)    9.08    18.15

            塩酸 (pH8.8)まで

 

0.5Mトリス塩酸緩衝液 

     50ml    100ml
トリス(g)    3.0    6.0

            塩酸 (pH6.8)まで

10%SDS  

     20ml   50ml
SDS(g)     2    5

 

泳動用緩衝液(10X)

100ml 200ml
トリス(g)   3 6
グリシン(g)    14 24

   

SDS試料液(2X)

   10ml    100ml
 0.5Mトリス−塩酸 (ml)    0.4   4.0
SDS (g)     0.376   3.76
グリセリン (ml)    4.0   40
2ーメルカプトエタノール(ml)   0.4   4.0
BPB(mg)    1   10

   

 <WORKING SOLUTIONS>

分離ゲル(ゲル2枚分)     

ゲル濃度   7.5%   10%   12.5   15%
アクリルアミド(ml)    6.8    9.1   11.3
蒸留水(ml)   22.4   20.1   17.9
1.5Mトリスー塩酸(ml)           10
10%SDS(ml)         0.4
過硫酸アンモニウム(ml)         0.4
  TEMED(ml)        0.004
合計        40.4ml

 

濃縮ゲル(ゲル2枚分) 

ゲル濃度     3%     5%
アクリルアミド(ml)    0.66     1.1
蒸留水(ml)     6.6     6.2 
0.5Mトリスー塩酸(ml)         2.5
10%SDS(ml)         0.1
過硫酸アンモニウム(ml) 0.1 0.1         0.1
TEMED(ml) 0.01 0.01         0.01
合計        (10.01ml)

 

泳動用緩衝液      

        2.5L
(10X)泳動用緩衝液(ml)        250
10%SDS(ml)         25
蒸留水で2.5Lにする

染色液

  100ml

  クマシーブリリアントブルー(g) ・・・・ 0.25 g 

  メチルアルコール(ml)・・・  50 ml 

  酢酸(ml)  ・・・・・・・・ 20 ml

  水(ml)  ・・・・・・・・・  30 ml

 

脱色液

  250ml   1l
メチルアルコール(ml)    63   250
酢酸(ml)   18    70
(ml)     169   680

 

 

 

2 核酸の抽出と分析

 

材料 エンドウ黄化芽生え

抽出バッファー

バッファー平衡化フェノール

フェノール・クロロホルム

フェノールの平衡化

 

核酸抽出用フェノール     500g

クロロホルム          3L

エタノール          500ml

アガロース

 

グリオキザール変性

各班2本づつ。 1g 5ml

アガロース電気泳動

 

3 植物細胞からの細胞骨格の分画

細胞骨格抽出用緩衝液(CSB)の調製

 

Stock Solutions

0.5N KOH 2.8g

蒸留水で100mlとする。

  

100 mM HEPES-KOH (pH7.5)

HEPES 1.19g

0.5N KOH 6.40ml

蒸留水で50mlとする。

 

100 mM 酢酸マグネシウム

酢酸マグネシウム        2.15g

蒸留水で100 mlとする。

 

10 % PTE(中性界面活性剤)

PTE

(Polyoxyethylene(10)tridecyl Ether) 1 ml

蒸留水                 9 ml

 

 

<Working Solution>

 

PCSB(CSB+PTE)

原液 用量 終濃度

100 mM HEPES-KOH(pH7.5) 5.0 ml 5 mM

100 mM 酢酸マグネシウム 10.0 ml 10 mM

0.5 M EGTA(GEDTA) 0.4 ml 2 mM

0.1 M PMSF-NaOH 1.0 ml 1 mM

10 % PTE 0.5 ml 0.5 %

蒸留水               83.1 ml    

100.0 ml

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