CSB法  

これまで、植物組織よりの細胞骨格画分の調製は困難であると同時に細胞骨格とリボソームなどの遺伝子発現器官は会合していないと考えられてきた。ところが、1985年に阿部とDaviesにより、従来の膜結合ポリソームの中に、細胞骨格結合と思われるタンパク質性の結合があることを明らかにした(1)。その後、6年間にわたり植物組織より細胞骨格とそれに結合するリボソームなどの遺伝子発現器官を抽出・分離する一般的方法の開発研究を続け1991年にCSB(Cytoskeleton Stabilizing Buffer)法を確立し発表した(2)。本方法は植物のみならず動物細胞などの細胞骨格を分離することにも適用できることがわかり(3、4)、4年後の1995年に植物細胞生物学の基本的方法としてMethods in Cell Biology (5)に掲載され、またリボソームの分画法においても新しい概念として導入された(6)。 この開発課程で明らかにされたリボソームと細胞骨格及び細胞内膜系との結合体の存在に関する研究は(7、8)、動物の細胞骨格の研究者の関心も引いておりこの分野で著名なPryme and Heskes 編による ”The  Cytoskeleton”の第3巻に共同研究者であるEric Davies とともに執筆している(9)。 さらに、これらの細胞骨格結合リボソームは翻訳活性が高く、細胞骨格画分自体に高い翻訳能能があるとともに細胞中でのタンパク質合成速度の測定から、リボソームが細胞骨格に結合することにより、タンパク質合成が一般的に活性化することがエンドウの根を用いた実験でも明らかになっている。(タンパク質合成における細胞骨格の役割)

 

Methods in Cell Biology 50B

  

*エンドウより分離した細胞骨格(上)とともに沈降した細胞質リボソーム(下)

CSB法は細胞分画法の一つであり、用いる緩衝液の基本組成は:5 mMへぺス−KOH(Hepes-KOH(pH 7.5)), 10 mM 酢酸カリウム、2 mM EGTA、1 mM フェニールメチールスルフォニールフロリド(Phenylsulfonyl fluoride: PMSFと略称される) である(2)。これに中性界面活性剤、浸透圧調整剤、種々の塩類などが目的に応じて加えられる(5)詳しく説明しています.ここをクリックしてください

注1:一価カチオン塩は加えない。中性界面活性剤が加えられている場合は酢酸カリウムなどの一価カチオン塩を加えると、細胞骨格およびそれと会合している成分が解離する。
 

 一般的に、250xg5分程度の遠心で核や葉緑体が沈降し、ペレットとして得られる。その上清を4,000xg−27,000xgで遠心することにより、種々のサイズの細胞骨格断片がそれに会合する要素とともに沈降し、ペレットとなる。 これらの細胞骨格ペレットには高いタンパク質合成能があるー>細胞骨格結合ポリソームによるタンパク質合成

  CSB法は、ほとんどの動・植物組織に適用でき、分画に要する時間は30分程度であり、極めて簡便で、再現性の良いことを特徴とする。以下に流れ図を示す。

1 CSB中で組織破壊(組織量の5−10倍量のCSBを用いる) ホモジナイザー、乳鉢等

2 ガーゼ、ミラクロス等のろ布でろ過

3 250xg 5分

核、葉緑体、デンプン粒、タンパク質小体 それらに会合する細胞骨格や大きな細胞骨格など、が沈降する。

4  4,000ー27,000xg 15分

 細胞骨格、それに会合するリボソームなど通常、主要な細胞骨格画分をなす 界面活性剤を加えない場合は小胞体、ミクロ ソーム、ディクチオソーム、ミトコンドリアなどが細胞骨格とともに沈降する。

5  50,000-100,000xg 30−60分

細かい細胞骨格断片

参考文献

1. Abe, S. and E. Davies. Quantitative isolation of undegraded polysomes from aged pea tissue in the absence of contaminants and artefacts. Plant Cell Physiology 26: 1499-1509 (1985).

2. Abe S, Davies E. Isolation of F-actin from pea stems: Evidence from fluorescence microscopy. Protoplasma 163: 51-61.(1991)

3. Abe S. Ito Y. Davies E. Cosedimentation of actin, tubulin and membranes in the cytoskeleton fractions from peas and mouse 3T3 cells. Journal of Experimental Botany, 43(252): 941-949 (1992).

4. Abe S., Ito Y., Doi H., Shibata K., Azama K., and Davies E. Distribution of actin and tubulin in the cytoskeletal fraction from a variety of plant and animal tissues. Memoir of College of Agriculture, Ehime University (1996)41 (1):1-10.

5 Abe S and Davies E. Methods for isolation and analysis of the cytoskeleton (Chapter 16). In Methods in Plant Cell Biology, Part B in Methods in Cell Biology, vol 50 (David Berl-Hahn ed), pp. 223-236, Academic press Inc, USA.  平成7年

6 Davies E, Abe S. Methods for isolation and analysis of polyribosomes (Chapter 15). In Methods in Plant Cell Biology, Part B in Methods in Cell Biology, vol 50 (David Berl-Hahn ed), pp. 209-222, Academic press Inc, USA.   平成7年 7. Ito Y, Abe S, E Davies. Colocalization of cytoskeleton proteins and polysomes with a membrane fraction from peas. Journal of Experimental Botany 45(271): 253-259 (1994).

8. Abe S, Ito Y, Davies E. Association of cytoskeletal proteins in the membrane-bound polysome fraction from peas using conventional polysome isolation buffers. Plant Physiology and Biochemistry 32 (4): 547-554 (1994).

9 Davies E, Fillingham BD, Abe S. The plant cytoskeleton. In The Cyto- skeleton: Biochemical, physiological and pathological aspects vol 1, Structure and Assembly (J.E. Hesketh and L.F. Pryme eds.pp.405-449 JAI press Inc. (1996) USA, ISBN:1-55938-689-4

10. Abe S, You W, Davies E. Protein bodies in corn endosperm are enclosed by and enmeshed in F-actin. Protoplasma 165: 139-149 (1991).

11. Davies E, Fillingham BD, Ito Y, Abe S. Polyribosomes from peas. VII. Initial characterization of a population of polysomes associated with the cytoskeleton. Cell Biology International Reports 15: 973-981 (1991).

12. You W, Abe S, Davies E. Cosedimentation of pea root polysomes with the cytoskeleton. Cell Biology International Reports, 16: 663-673 (1992).

13. Abe S, Ito Y, Davies E. The presence of latent RNase activity in, and release of undegraded polysomes from, a cytoskeletal fraction from peas. Memoirs of College of Agreculture, Ehime Univ. 37: 11-25 (1992).

14. Davies E, Comer EC, Lionberger JM, Stankovic B, Abe S. Cytoskeleton-bound polysomes in plants. III. Polysome-cytoskeleton-membrane interactions in corn endosperm. Cell Biology International 17:331-340 (1993).

15. Stankovic B, Abe S, Davies E. Co-localization of polysomes, cytoskeleton, and membranes with protein bodies from corn endosperm. Protoplasma 177: 66-72 (1993).

16 Abe S, Ito Y, Davies E. Isolation of a heparin sensitive, ribosome sedimenting factor from the cytoskeleton fractions of peas and corn.  Plant Physiology and Biochemistry 33(4): 463-470 (1995).


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